分子生物学3
真核基因表达的转录水平调控
真核细胞与原核细胞在基因转录，翻译及DNA的空间结构方面存在如下差异：
1，真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，原核生物中常见的多基因操纵子形式在真核细胞中比较少见。
2，真核细胞的DNA组蛋白和大量非组蛋白结合，只有一小部分DNA是裸露的。
3，高等真核细胞DNA中大部分不转录，真核细胞中有一部分由几个或几十个碱基组成的DNA序列，在整个基因组中重复几百次甚至上百万次。此外，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。
4，真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数，这种能力在原核生物中极为罕见。
5，原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于转录起始位点上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶对它的结合。真核生物中，基因转录的调节区则大得多，它们可能远离核心启动子几百个甚至上千个碱基对。虽然这些调节区也能与蛋白质结合，但是并不直接影响启动子区对与RNA聚合酶的接受程度，而是通过改变整个所控制基因5'上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。
6，真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转座穿过核膜，到达细胞质基质后，才能被翻译成蛋白质。原核生物中不存在这样严格的空间间隔。
7，许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能被顺利地翻译成蛋白质。
基因转录调节的基本要素包括顺式作用元件(coding region)，反式作用因子(trans-acting factor)和RNA聚合酶(RNA polymerase)。
顺式作用元件是指启动子和基因的调节序列。主要包括启动子，增强子(enhancer)，沉默子(silencer)等。反式作用因子是指能够结合在顺式作用元件上调控基因表达的蛋白质或者RNA。原核生物只有一种RNA聚合酶，真核生物有3种RNA聚合酶，催化转录不同的RNA产物。由于真核生物3种RNA聚合酶中，只有RNA聚合酶Ⅱ能够转录信使RNA前体，并在加工成熟后按照三联子密码的原理翻译成蛋白质产物，我们这里主要讨论RNA聚合酶Ⅱ的基因转录及其调控过程。
真核基因启动子由核心启动子和上游启动子两部分组成，是在基因转录起始位点(+1)及其5'上游100~200bp以内的一组具有独立功能的DNA序列，每个元件长度为7~20bp，是决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始位点和转录频率的关键元件。
1，核心启动子(core promoter)是指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的，最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游-25~-30bp处的TATA区。核心启动子单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录。
2，上游启动子元件(upstream promoter element , UPE)? 包括通常位于-70 bp附近的CAAT区(CCAAT)和GC区(GGGCGG)等，能通过TF Ⅱ D复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。
包括从转录起始位点到RNA聚合酶Ⅱ转录终止处的全部DNA序列。
RNA聚合酶Ⅱ是一类能够直接或间接与启动子核心序列TATA区特异结合，并启动转录的调节蛋白。RNA聚合酶Ⅱ在转录因子帮助下形成转录起始复合物。RNA聚合酶Ⅱ由至少10~12个亚基组成，各亚基的相对分子质量在1X10^4~2.4X10^5，有些亚基也在聚合酶Ⅰ，Ⅲ中***用。
4，RNA聚合酶Ⅱ基础转录所需的蛋白质因子(以"TF Ⅱ"表示)在生理条件下，RNA聚合酶Ⅱ基础转录所需的蛋白质因子形成转录起始复合物。TF Ⅱ D，TF Ⅱ B，和TF Ⅱ F与RNA聚合酶Ⅱ可在启动子上形成最初级复合物，开始转录mRNA，加入TF Ⅱ E和TF Ⅱ H后形成完整的转录复合物并转录出长链RNA，加入TF Ⅱ A可进一步提高转录效率。RNA聚合酶Ⅱ沿着模板滑动时TF Ⅱ D及TF Ⅱ A滞留在转录起始位点上，其他因子随聚合酶向模板DNA的3'端移动。关于RNA聚合酶Ⅱ如何整合成为转录起始复合物从而发挥作用，目前有两种假说，一种认为是一步结合，另一种认为是分步结合。
增强子是指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。
真核生物启动子和增强子是由若干DNA序列元件组成的，由于它们常与特定的功能基因连锁在一起，因此被称为顺式作用元件。这些序列组成基因转录的调控区，影响基因的表达。在转录调控过程中，除了需要调控区外，还需要反式作用因子。根据不同功能，常将反式作用因子分为以下三类：具有识别启动子元件功能的基本转录因子；能识别增强子或沉默子的转录调节因子以及不需要通过DNA-蛋白质相互作用就参与转录调控的***调节因子。
实验中，常将前两类反式作用因子统称为转录因子(transcription factor, TF),包括转录激活因子(transcriptional activator)和转录阻遏因子(transcriptional repressor)。这类调节蛋白能识别并结合转录起始位点的上游序列或远端增强子元件，通过DNA-蛋白质相互作用而调节转录活性，并决定不同基因的时间，空间特异性表达。
***调节因子本身无DNA结合活性，主要通过蛋白质-蛋白质相互作用影响转录因子的分子构象，从而调节转录活性。实验中常将与转录激活因子有协同作用的那一类***调节因子称为***激活因子，
所有***激活因子都能识别靶位点(启动子，增强子)，而靶位点的特异性则由DNA结合域的特定序列决定。DNA结合域结合在特定的序列上，从而将激活因子上的转录激活域带到基础转录区域附近。
在植物学相关领域，科研工作者利用相关原理构建出诱导型的含有标签的转化载体，首先，设计特殊的启动子，保证融合的转录因子(包括DNA结合域，转录激活域和受体调控域)组成型表达。一旦实验中加入化学小分子，该小分子与受体调控结构域相结合，导致融合表达的转录因子构象发生变化，由细胞质基质转移入核内。融合蛋白就能特异性识别相关的DNA结合域并与之结合，该蛋白的转录激活域就能激活相关基因高水平表达。(简单来说吧，就是一个转录因子，它有三个域：1，结合DNA的，2，结合RNA聚合酶的，3，结合调节一些化学调控因子的。加入某些化学小分子后转录因子被激活，进而激活基因表达。)
转录因子：识别TATA区的TF Ⅱ D，识别CAAT区的CTF,识别GGGCGG的SP1以及识别热激蛋白启动区的HSF。已知每个细胞中可含有约60 000个SP1，而CTF的含量则高达每个细胞300 000个。
反式作用因子是能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。常见的DNA结合域包括碱性氨基酸结合域，酸性激活域，谷氨酰胺(Q)富含域，脯氨酸(P)富含域等。通常情况下，配体调节受体大多有DNA结合域和转录激活域。而甾醇类受体通常都是转录因子，其N末端都有保守的DNA结合域，C末端都有激素结合域。
1，螺旋-转折-螺旋(helix-turn-helix,HTH)结构(这个结构是要去结合DNA的) 这一类蛋白质分子中有至少两个α螺旋，中间由短侧链氨基酸残基形成"转折"，近羧基端的α螺旋中氨基酸残基的替换会影响该蛋白在DNA双螺旋大沟中的结合。控制酵母交配型MAT基因座以及果蝇体节发育的调节基因(antp,ftz,ubx)等同源盒(homeobox)基因所编码的蛋白都有HTH结构。与DNA相互作用时，同源域蛋白的第一，二两个螺旋往往靠在外侧，其第三个螺旋则与DNA大沟相结合，并通过其N端的多余臂与DNA的小沟相结合。
同源域是指编码60个保守氨基酸序列的DNA片段，它广泛存在于真核生物基因组内，由于最早从果蝇 homeotic loci(该遗传位点的基因产物决定了躯体发育)中克隆得到而命名，同源转换基因与生物有机体的生长，发育和分化密切相关。许多含有同源转换区的基因具有转录调控功能，同源转换区氨基酸序列很可能参与形成DNA结合区。如下总结了部分含同源转换区转录因子所识别的DNA序列，Oct-1，Oct-2，与Pit-1/GHF-1所识别的核心序列仅有一个碱基之差，而果蝇en,ftz和ubx基因产物能识别完全相同的DNA序列。eve基因产物除识别与前者相同的序列外，还识别另一个靶序列。
Oct-1 和 Oct-2专一结合于启动子内8碱基区，它们都含有75个氨基酸的pou区和60个氨基酸的同源转换区。尽管Oct-1和Oct-2 中的同源盒与经典的果蝇同源转换区变异较大(60个氨基酸中只有20个相同，外加8个保守性替换)，该区在这两个蛋白质中却是高度保守的(60个氨基酸中有53个相同)。
2，锌指(zinc finger)结构? 锌指结构家族蛋白大体可分为锌指，锌钮(twist)，锌簇(cluster)结构，其特有的半胱氨酸和组氨酸残基之间氨基酸残基数基本恒定，有锌参与时才具备转录调控活性。重复的锌指结构都是将一个α螺旋与一个反向平行β片层的基部以锌原子为中心，通过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形成配位键相连接，锌指环上突出的赖氨酸，精氨酸参与DNA的结合。
锌指结构中每一个α螺旋可以特异的识别3~4个碱基。利用不同的锌指结构识别特异DNA序列的特点以及核酸酶能够切断靶DNA的原理，科研工作者获得了一类被称为锌指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)的新型限制性内切核酸酶。根据改变锌指结构通用序列中7个 X序列就能识别不同的DNA序列这一特征，人工设计识别特异DNA序列的α螺旋，用TGEK作为螺旋间的连接序列，构建成对人工锌指结构域和Fok I 融合蛋白(ZFN)，就能在指定区域切断DNA双链。
3，碱性亮氨酸拉链(basic-leucine zipper)，即bZIP结构。肝，小肠上皮，脂肪细胞以及某些脑细胞中存在的一大类C/EBP家族蛋白，它们的特征是能够与CCAAT区和病毒的增强子结合。C/EBP家族蛋白的羧基端35个氨基酸残基具有能形成α螺旋的特点，其中每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，这就导致第7个亮氨酸残基都在螺旋的同一方向出现。
4，碱性-螺旋-环-螺旋(basic-helix/loop/helix)，即bHLH结构 在免疫球蛋白κ轻链基因的增强子结合蛋白E12与E47中，羧基端100~288个氨基酸残基可形成两个双性α螺旋，被非螺旋的环状结构所隔开，
转录活化结构域
在真核生物中。反式作用因子的功能由于受蛋白质-蛋白质之间相互作用的调节变得精密复杂，完整的转录调控功能通常以复合物的方式来完成，这就意味着并非每个转录因子都直接与DNA结合。因此，是否具有转录活化域就成为反式作用因子中唯一的结构基础。反式作用因子的功能具有多样性，其转录活化域也有多种，通常依赖于DNA结合结构域以外的30~100个氨基酸残基。不同的转录活化域大体上有下列几个特征结构：
1，带负电荷的螺旋结构
2，富含谷氨酰胺的结构
3，富含脯氨酸的结构
利用顺式作用元件和反式作用因子间相互作用的原理，科研人员研发了许多调控基因表达的技术。其中最新的应用当属TALEN技术(TALEN=transcription activator-like effector+FokI nuclease fusion protein)，该技术利用转录激活因子34个氨基酸重复肽段中第12，13个氨基酸可以特异识别DNA方法碱基的特性，串联合成可识别目的碱基序列的TALE蛋白，与内切核酸酶FokI融合表达，可切割特异识别序列下游9~13bp，从而实现敲除指定内源基因的功能。
在真核生物中，发生在转录之前的，染色质水平上的结构调整，称之为基因表达的表观遗传调控。主要包括DNA修饰(DNA甲基化)和组蛋白修饰(组蛋白乙酰化，甲基化)两个方面。
分子生物学最新研究表明，在个体发育过程中，用来合成RNA的DNA模板也会发生规律性变化，从而调控基因表达和生物体的发育。
高度重复基因的形成通常与个体分化阶段DNA的某些变化有关。例如，一个成熟的红细胞能产生大量的可翻译出成熟珠蛋白的mRNA，而其前体细胞却不产生珠蛋白。许多情况下，这种变化是由于基因本身或其拷贝数发生了永久性变化。这种DNA水平的调控是真核生物发育调控的一种形式，包括基因丢失，扩增，重排和移位等方式，通过这些方式可以消除或变换某些基因并改变它们的活性。这些调控方式使基因组发生改变，与转录及翻译水平的调控不同。
1，"开放"型活性染色质(active chromatin)结构对转录的影响 真核基因的活跃转录是在常染色质上进行的。转录发生之前，染色质常常会在特定区域被解旋松弛，形成自由DNA。这种变化可能包括核小体结构的消除或改变、DNA本身局部结构的变化甚至从右螺旋型变为左螺旋型(Z-DNA)等，这些变化可导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA结合，诱发基因转录。。用DNA酶I处理各种组织的染色质时，发现处于活跃状态状态的DNA更容易被DNA酶I所降解。
研究发现，活跃表达的基因所在染色质上一般含有一个或数个DNA酶I超敏感位点(hypersensitive site),它们大多位于基因5'端启动区，少数在其他位置。而非活性基因的5'端相应位点却不表现对DNA酶I的超敏感性。有人用专一切割单链DNA的SI核酸酶处理该基因活跃表达的染色体DNA，证实有DNA被水解，说明该基因活跃表达时启动区部分序列可能解开成单链，从而不能继续缠绕在核小体上，使启动区DNA "裸露" 在组蛋白表面，形成对DNA酶I的超敏感现象。上述实时说明，超敏感位点的产生可能是染色质结构规律性变化的结果。正是由于这种变化，使DNA容易与RNA聚合酶和其他转录调控因子相结合，从而启动基因表达，同时也更容易被核酸酶降解。
有证据表明，存在"灯刷形"染色体(lamp brush)上的环形结构可能与基因的活性转录有关。
2，基因扩增
基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需求，是基因活性调控的一种方式。
3，基因重排与变换
将一个基因从远离启动子的地方移到距离它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。。。或将几个相距较远的基因片段通过染色体内DNA重组把几个相隔较远的基因片段连接在一起，从而产生具有表达活性的蛋白。
DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，这一修饰途径可能存在于所有高等生物中并与基因表达调控密切相关。大量研究表明，DMA甲基化能关闭某些基因活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构，DNA构象，DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。研究证实，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。
1，DNA甲基化
DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中。在染色体水平上，DNA甲基化在着丝粒附近水平最高；在基因水平上，DNA甲基化高水平区域涵盖了多数的转座子，假基因和小RNA编码区。甲基化似乎对于长度较短的基因有较强的转录调控能力，而对长基因的调控能力十分微弱。实验证明，这个过程不但与DNA复制起始及错误修正时的定位有关，还通过改变基因的表达参与细胞的生长，发育过程及染色体印迹，X染色体失活等的调控。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA,这里6都是上标)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列CpXpG,CCA/TGG和GATC中。因为高等生物CpG二核苷酸序列中的C通常是甲基化的，极易自发脱氨，生成胸腺嘧啶，所以CpG二核苷酸序列出现的频率远远低于按核苷酸组成计算得到的频率。由于这些CpG二核苷酸通常成串出现在DNA上，这段序列往往被称为CpG岛。
真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种被称为日常型甲基转移酶，另一种是从头合成型甲基转移酶，前者主要在家里化母链(模板链)指导下使处于甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化，该酶催化特异性极强，对半甲基化的DNA有较高的亲和力，使新生的半甲基化DNA迅速甲基化，从而保证DNA复制及细胞分裂后甲基化模式不变。后者催化未甲基化的CpG成为mCpG，它不需要母链指导，但速度很慢。这类甲基化酶是导致特异基因受甲基化调控的主要因子，在基因表达的变观遗传学研究中有十分重要的地位。
2，DNA甲基化抑制基因转录的机理
DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。研究表明，当组蛋白H1与含CCGG序列的甲基化或非甲基化DNA分别形成复合体时，DNA的构型存在很大的差别，甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。人们用序列相同但甲基化水平不同的DNA为材料，比较其作为RNA聚合酶转录模板的活性，发现甲基的引入不利于模板与RNA聚合酶的结合，从而降低其体外转录活性。
5-甲基胞嘧啶在DNA上并非随机分布，基因的5'端和3'端往往富含甲基化位点，而启动区DNA分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关。对于弱启动子来说稀少的甲基化就能使其完全失去转录活性。当这一类启动子被增强时(带有增强子)，即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。若进一步提高甲基化密度，即使增强后的启动子仍无转录活性。因为甲基化对转录的抑制强度与MeCP1(methyl CpG-binding protein 1)结合DNA的能力成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性。
DNA甲基化还提高了该位点的突变频率。
3，DNA甲基化与X染色体失活
X染色体失活是发育过程中独特的调节机制。雌性胎生哺乳动物中两条X染色体之一在发育早期随机失活，以确保与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同。
组蛋白乙酰化对基因表达的影响：
1，组蛋白的基本组成：组蛋白(histone)是组成核小体的基本成分，核小体(nucleosome)是组成染色质的基本结构单元。核小体由组蛋白八聚体(由两个包含H2A,H2B,H3,H4的四聚体组成)和缠绕两圈的DNA组成。在相邻的核小体之间有一个20~200bp的间隔区，在电子显微镜下，一列核小体看上去像一串珠子，每个珠子的直径大约是10nm。另一个组蛋白H1结合在核小体核心之外，起到稳定核小体序列和染色质的高级结构的作用。
2，核心组蛋白的乙酰化和去乙酰化
核心组蛋白朝向外部的N端部分被称为"尾巴"，可被组蛋白乙酰转移酶和去乙酰转移酶修饰，加上或去掉乙酰集团。如下图是已报道的组蛋白N端"尾巴"主要被修饰位点。
3，组蛋白乙酰基转移酶
催化组蛋白乙酰化反应的组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)。目前已发现的HAT主要有两类：一类与转录有关，另一类与核小体组装以及染色质的结构有关。HAT并不是染色质结合蛋白，但是可以通过与其他蛋白相互作用来影响染色质的结构。许多转录激活因子都有HAT活性，与转录有关的HAT催化亚基是酵母调控蛋白质GCN5的同源物，而GCN5本身具有乙酰化组蛋白H3和H4的活性。
TAF Ⅱ 250组蛋白乙酰转移酶是TF Ⅱ D 复合物的一个亚基它的主要功能是与启动子结合协助起始转录，能使组蛋白H3和H4乙酰化。转录***激活子PCAF也能使这两个组蛋白乙酰化。组蛋白乙酰转移酶p300/CBP也是转录***激活子，通过与增强子结合蛋白相互作用来调节转录，能使组蛋白H2A,H2B,H3,H4乙酰化。与激素受体协同作用的转录***激活子ACTR也是一种作用于H3和H4的组蛋白乙酰转移酶。
4，组蛋白去乙酰化
组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)负责去除组蛋白上的乙酰基团，目前研究比较深入的是人类中的HDAC1和酵母中的Rpd3。HDAC和Rpd3都形成很大的蛋白复合体发挥作用。Rpd3能特异性去除组蛋白上的乙酰基团，使核小体相互靠近，并在转录***抑制子Sin3及R的协同作用下，抑制基因转录。
5，组蛋白乙酰化及去乙酰化对基因表达的影响
组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶通过使组蛋白乙酰化和去乙酰化对基因表达产生影响。组蛋白N端"尾巴"上赖氨酸残基的乙酰化中和了组蛋白尾巴的正电荷，降低了它与DNA的亲和性，导致核小体构象发生有利于转录调节蛋白与染色质相结合的变化，从而提高了基因转录的活性。
组蛋白甲基化对于真核基因表达的调控
基因沉默(又称RNA沉默，RNA silencing)是指真核生物中由双链RNA诱导的识别和清除细胞中非正常RNA的一种机制。通常情况下基因沉默可以分为转录水平基因沉默(transcriptional gene silencing)和转录后水平基因沉默(post-trancriptional gene silencing)
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的技术。由于RNAi技术可以特异性降低或关闭目的基因表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和疾病的基因治疗领域。
1，干扰小RNA(small interfering RNA,siRNA)：
实验表明，双链RNA对内源基因表达的干扰效率远高于单链的RNA，真正起到RNA沉默作用的应该是双链RNA。此外，研究还发现，引入的外源RNA只对同源基因有高沉默效率，暗示它们之间可能需要形成配对的基础。2000年，RNAi研究有了重要进展，揭示了dsRNA介导的RNAi现象的许多重要特性。研究者开发了一套基于果蝇细胞提取物的体外RNAi研究系统，发现无论是否有靶mRNA的存在，引入的外源dsRNA的正义，反义链都会被切割成21~23nt的小片段，相对应的靶mRNA也会被降解成长度差为21~23nt的片段，说明这种降解很可能是由21~23nt小片段介导的，并且这种降解需要ATP提供能量。现在，已统一将介导这种沉默现象的小片段RNA称为干扰小RNA(small interfering RNA,siRNA)。
2，siRNA的生物合成
病毒RNA以及由环境，实验因素引入的外源RNA都可能是siRNA的来源。此外，基因组重复片段，转座子等序列也可能产生siRNA。通常一个长为21nt的双链小RNA，其中19nt形成配对双链，3'端各有两个不配对核苷酸序列而5'端为磷酸基团。其中一条链为引导链(guide strand)，介导mRNA的降解；另一条链为乘客链(passenger strand)，在siRNA形成有功能的复合物前被降解。
siRNA的产生过程主要包括着3个核心步骤：1，经Dicer切割形成双链小片段；
2，组装复合物；
3，形成有活性的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)
(1)Dicer切割? Dicer是一类RNase Ⅲ 蛋白，主要包括一对RNase Ⅲ 结构域，双链RNA结合域，解旋酶结构域和PAZ结构域。PAZ结构域可以结合双链RNA的两个3'不配对核苷酸。两个RNase Ⅲ 结构域形成分子内二聚体结构，各催化剪切一条链，产生双链断裂。结构生物学研究表明，PAZ结构域和 RNase Ⅲ 催化切点约相距6.5nm，与20多个核苷酸的长度相当，因此，Dicer本身可以作为一把裁剪的尺子，用来切出长为21~23nt的siRNA。
(2)R2D2的装配? siRNA的装载需要双链RNA结合蛋白R2D2的帮助。R2D2包含两个一前一后的双链RNA结合结构域，有报道认为R2D2可以结合双链小RNA热稳定性较高的一端。
(3) RISC的装配和成熟?
。。。
miRNA
真核基因其他水平上的表达调控
蛋白质磷酸化对基因转录的调控